黄麻再生遗传转化体系优化及UGPase、CesA1、CCoAOMT基因克隆与功能鉴定

【摘要】黄麻(CorchoruscapsularisL.),又称绿麻,为椴树科黄麻属一年生草本韧皮纤维作物,是世界上最重要的长纤维作物之一,产量和种植面积仅次于棉花。由于黄麻纤维产量高、有光泽、吸湿性能好、散水快、易降解、质地柔软的特点,在商业上有金色纤维之称。近年来随着育种家的不断努力,黄麻纤维产量有了大幅度的提高,但由于黄麻中纤维素总体含量较低和木质素含量较高,导致黄麻韧皮纤维细胞壁木质化、单纤维细胞较短、粗硬、弹性小、可纺支数低等,严重影响黄麻纤维在面料纺织品上的有效应用和经济效益。植物组织培养是基因工程操作的重要基础,在大部分植物中,愈伤组织是实现农杆菌介导遗传转化的直接受体,同时也是获取原生质体、体细胞杂交、植株再生等的重要基础。目前有关黄麻组织培养和再生体系的研究较少,这严重制约着黄麻基因工程的发展。本研究主要研究内容为：利用不同公司的RNA提取试剂盒和和提取方法,优化了高质量黄麻RNA提取方法；利用优化的快速获取基因5’端的技术体系,获得了黄麻纤维素合成相关基因UGPase、CesAl和CCoAOMT基因cDNA片段并对该基因进行了功能鉴定；利用不同培养基和激素配比,研究了黄麻组织培养再生体系；利用韧皮部特异启动子定向沉默黄麻CCoAOMT基因。最后利用所获得的UGPase基因转化黄麻,来研究利用UGPase和CCoAOMT基因改良黄麻品质的可行性,主要研究结果如下：1.1黄麻组织培养及遗传转化体系的优化以圆果种黄麻“黄麻179”为材料,确定了以子叶和幼茎为外植体产生愈伤组织最佳培养基分别为：MS培养基中添加0.5mg/LTDZ+0.1mg/L或0.5mg/LIAA,MS培养基中添加2.0mg/L6-BA+0.5mg/LIAA和MS培养基中添加0.25mg/LTDZ+0.1mg/L或0.5mg/LNAA,MS培养基中添加0.5mg/L6-BA+0.5mg/LNAA。子叶愈伤组织再分化培养基为MS+0.5mg/L6-BA+0.5mg/LNAA,幼茎愈伤组织再分化培养基为MS+0.5mg/LTDZ+2.0mg/LIAA,通过筛选不同种类的褐变抑制剂,最终确定以0.1%的植酸作为黄麻组培中褐变抑制剂效果较好,不定芽诱导中,最终确定子叶节不定芽诱导最佳培养基是MS+2.0mg/L6-BA+0.25mg/LNAA+100mg/LHC。诱导率达到36.4%,不定芽或苗根诱导最佳培养基为MS+0.5mg/L6-BA+1mg/LNAA。选用200mg/LCef作为子叶节遗传转化的抑制农杆菌生长的抑制剂,20mg/L的潮霉素作为转化后子叶节的筛选临界浓度,最后采用新鲜外植体,菌液中添加100μM的乙酰丁香通,浓度调整为OD值为0.5,侵染时间为10min,获得的GUS染色率较高,所有GUS染色过的植株经过PCR反应均能扩增出目的条带。研究结果为今后黄麻基因工程育种提供了重要的途径。1.2黄麻尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(UGPase)基因克隆与功能鉴定成功分离了黄麻尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(UGPase),暂命名为CcUGPasel,该基因cDNA全长1,395bp,编码465个氨基酸,编码蛋白的分质量51.15619kD,理论等电点是6.11,CcUGPase生物信息学分析表明,该基因属于糖基转移酶家族成员,RT-PCR分析表明,该基因在根、茎皮、叶中均有表达,其表达量为茎皮>根>叶,在40天和120天时期表达较高,在拟南芥中过量表达CcUGPasel基因表明,转基因植株生长速率加快、高度增加,纤维素含量比对照增加(8%-17%),木质素含量和节间距没有明显变化。表明该基因在植物的生长发育和纤维素代谢过程中起重要的调控作用。1.3黄麻纤维素合成酶基因(CcCesA1)克隆与功能鉴定克隆黄麻纤维素合成酶CcCesA1基因除5’端500bp序列外的全部cDNA。其序列长度为2529bp,编码627氨基酸残基,经Blast基因比对和蛋白质结构分析,确定是黄麻纤维素合成酶基因。半定量RT-PCR分析表明,CcCesA1在植株不同部位表达量具组织差异性,依次为茎部韧皮>根>叶>顶芽>麻骨。利用CcCesA1基因部分cDNA序列和3’UTR区,构建黄麻CcCesA1基因反义载体,用测序验证的阳性质粒转化模式植物拟南芥。Southern结果表明,外源基因以单拷贝方式整合进入基因组,转基因拟南芥生长严重受阻,植株变得矮小且茎部易弯曲倒伏,角果数量变少,长度变短,纤维素含量有不同程度的降低,本研究结果表明,所克隆的黄麻CcCesA1基因除了参与植物其他生理代谢过程外,还参与纤维素的生物合成。1.4黄麻咖啡酰-辅酶A甲基转移酶(CCoAOMT)基因克隆与功能鉴定成功分离了黄麻咖啡酰-辅酶A甲基转移酶(CCoAOMT)基因,暂命名为CcCCoAOMT1,该基因cDNA全长609bp,编码202个氨基酸,编码蛋白的分质量22.59887kD,理论等电点是5.59,CcCCoAOMT1生物信息学分析表明,该基因属于PLN02589Methyltransf-3氧甲基转移酶家族成员,RT-PCR分析表明,该基因在根、茎皮、麻骨、叶中均有表达,其表达量为麻骨>根>茎皮>叶,转基因拟南芥研究结果表明,携带CcCCoAOMT1基因的拟南芥与对照相比植株高度、角果长度、茎秆硬度增加,木质素含量比对照增加(17%-21%),表明该基因在植物的生长发育和木质素代谢过程中起关键调控作用。1.5尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(TGPase)转化黄麻研究以农杆菌介导转化无菌黄麻子叶节,提取所有转化植株叶片DNA,对转化植株进行PCR和Southern杂交检测,最后共确定有7株为转基因阳性植株,对转基因当代植株分析表明,与对照相比转基因的植株高度明显增加,韧皮纤维中纤维素含量与对照相比增加(18%-22%)。该研究结果为利用UGPase基因改良黄麻品质提供了新的视角。1.6黄麻(CCoAOMT)基因RNAi载体和人工定向沉默载体构建及转化黄麻研究利用韧皮部特异启动子启动GUS基因在烟草中的表达结果表明,与35S相比,韧皮部特异启动子可驱动GUS基因在韧皮部中表达,而在其他部位不表达或表达量较低。利用TCK303质粒和PNW55模板质粒分别构建了CCoAOMT基因RNA干扰载体和人工1niRNA定向沉默载体,农杆菌介导方法转化无菌黄麻子叶节,初步PCR检测结果表明外源基因已整合黄麻基因组中,Southern杂交结果正在检测中,有望筛选出黄麻CCoAOMT基因被定点抑制的转化植株,为后期研究重要材料。
【作者】张高阳；
【导师】祁建民；
【作者基本信息】福建农林大学，作物遗传育种，2014，博士
【关键词】黄麻；UGPase；纤维素；木质素；组织培养；特异启动子；

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